Lorsque Mario et Luigi se font aspirer à l'intérieur du corps de Bowser, ils explorent un monde en 2-D où ils bondissent de défi en défi, résolvent des casse-têtes et augmentent de niveau à mesure qu'ils combattent des ennemis. Pour la première fois dans la série, les joueurs pourront incarner Bowser!

Les joueurs sont aux commandes de deux scénarios distincts qu'ils peuvent alterner à volonté. Dans l'un des scénarios, Bowser essaie de stopper son ennemi numéro un de s'emparer de son château. Pendant ce temps, à l'intérieur du corps de Bowser, les microscopiques Mario et Luigi doivent retrouver leur chemin à travers différents défis et garder leur sang-froid s'ils veulent trouver un moyen de s'échapper. À l'insu de Bowser, Mario et Luigi prennent le contrôle de son corps.

Pour améliorer leur performance lors des batailles et des défis, les joueurs doivent apprendre à maîtriser les boutons. Dans certains combats, Bowser prend tellement d'expansion que les joueurs doivent tourner leur console Nintendo DS™ ou Nintendo DSi™ sur le côté, souffler dans le microphone ou toucher l'écran tactile avec le stylet pour faire avancer l'histoire.

Le jeu comporte les mêmes dialogues hilarants qui ont fait la popularité de la série Mario & Luigi.

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